快速掌握PCR儀的使用秘籍

　　PCR儀利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專(zhuān)一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。
 

　　PCR儀的操作規(guī)程：
 

　　過(guò)去標(biāo)準(zhǔn)的PCR操作程序是將PCR儀必需反應(yīng)成份分別加入一微量離心管中，然后置于一定的循環(huán)參數(shù)條件下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增。具體如下：
 

　　(1)向一微量離心管中依次加入
 

　　DNA模板　　　　　　 102-105拷貝
 

　　引物　　　　　　　　　 各1μmol/L
 

　　dNTP　 　　　　　 各200μmol/L
 

　　10×PCR緩沖液　　1/10體積
 

　　ddH2O　　　　　補(bǔ)到終體積(終體積50μl-100μl)
 

　　混勻后，離心15s使反應(yīng)成分集于管底。以上步驟僅在實(shí)驗(yàn)研究用，現(xiàn)在商品化試劑已將dNTP、10×PCR緩沖液，引物，ddH2O混合在一起，反應(yīng)體積為20-25μl，只要試驗(yàn)人員加入處理好的樣品就可以了。
 

　　(2)加石蠟油50-100μl于反應(yīng)液表面以防蒸發(fā)。置反應(yīng)管于97℃變性10min。
 

　　(3)冷至延伸溫度時(shí)，加入1-5u Taq DNA聚合酶，離心30s使酶和反應(yīng)液充分混合。現(xiàn)在臨床使用試劑酶通常已加入反應(yīng)液中。
 

　　(4)PCR儀的循環(huán)程序?yàn)椋?4℃變性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循環(huán)30-35次。然后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72℃溫育5min，以確保充分延伸。