進(jìn)口PCR儀的常見問題詳細(xì)解答

　　可能的原因：

　　*RNA模板質(zhì)量低

　　*對(duì)mRNA濃度估計(jì)過高

　　*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足

　　*同位素磷32過期

　　*反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl

　　2. 進(jìn)口PCR儀擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺

　　*zui常見的原因在于您的反應(yīng)體系是進(jìn)口PCR儀的反應(yīng)體系而不是RT-進(jìn)口PCR儀的反應(yīng)體系

　　*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)

　　*建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA

　　**鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行進(jìn)口PCR儀擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10

　　*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。

　　*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：

　　a. 將*鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。

　　b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行*鏈反應(yīng)。

　　3. 產(chǎn)生非特異性條帶

　　*用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的進(jìn)口PCR儀結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

　　*在進(jìn)口PCR儀反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。

　　*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-進(jìn)口PCR儀結(jié)果。

　　4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶

　　*在進(jìn)口PCR儀反應(yīng)體系中*鏈產(chǎn)物的含量過高

　　*減少引物的用量

　　*優(yōu)化進(jìn)口PCR儀反應(yīng)條件/減少進(jìn)口PCR儀的循環(huán)次數(shù)

　　*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。

　　5. 進(jìn)口PCR儀產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

　　*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

　　*對(duì)于長片段的進(jìn)口PCR儀，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

　　6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果

　　*通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將*鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

　　*有可能是引物二聚體的條帶

　　7. 進(jìn)口PCR儀擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

　　*有可能是由于模板量過高而導(dǎo)致進(jìn)口PCR儀結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將*鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。

　　*另外，在二次進(jìn)口PCR儀時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

　　8. SSⅢ與SSⅡ有何不同？

　　*具有更高的熱穩(wěn)定性（達(dá)50℃）

　　*具有更長的半衰期（達(dá)220分鐘）

　　*對(duì)進(jìn)口PCR儀無抑制

　　*干冰運(yùn)輸

　　*Tdt活性更低

　　9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

　　ThermoScript如果保存不當(dāng)會(huì)引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。

　　10. 為什么使用基因特異性引物（GSP）？

　　GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。

　　11. 進(jìn)口PCR儀什么情況下需要使用RNase H？

　　在*輪進(jìn)口PCR儀中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)