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    酶標(biāo)儀利用”無創(chuàng)”技術(shù)檢測活細胞熒光蛋白

    更新時間:2016-03-30      點擊次數(shù):2507
             在過去的五年中,熒光蛋白在監(jiān)測體內(nèi)生物學(xué)研究中,起到越來越重要的作用。源于維多利亞多管發(fā)光水母中的綠色熒光蛋白(GFP)是zui早被我們應(yīng) 用的熒光蛋白,但是隨著時間的推移,現(xiàn)在我們可以使用的熒光蛋白種類也越加豐富,包括加強型的變異GFP蛋白、從其他種類水母中發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白和珊瑚礁蛋 白。它們都可以在眾多的細胞和組織中被克隆復(fù)制,從細菌到酵母,從植物到哺乳動物。這些熒光蛋白穩(wěn)定、細胞毒性小、而且不需要額外的輔助也能在體內(nèi)產(chǎn)生可 見的熒光。因此,它們可以被用作分子靶標(biāo)或者獨立的報告因子去視化、追蹤和定量多種不同的細胞進程,包括細胞合成與代謝,蛋白轉(zhuǎn)運,基因誘導(dǎo)和細胞譜系。 不同的熒光蛋白具有不同的顏色,因此也可被用于多重檢測。這些熒光蛋白都能被熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測到。但是相應(yīng)的,如果我們不做細胞分選或監(jiān)測細胞 內(nèi)遷移,微孔板熒光讀板儀將是一個更好、更方便和更高通量的檢測系統(tǒng)。下面,我們將會向大家展示Molecular Devices酶標(biāo)儀如何利用”無創(chuàng)”技術(shù)檢測活細胞熒光蛋白。
    我們將從BD Biosciences Clontech公司獲得的三株HEK-293細胞系進行不同熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。這次研究的目的:1)優(yōu)化三株細胞系的波長設(shè)置,2)通過稀釋細胞系來確定檢測下限LLD,3)證明在一種細胞系中識別另一種細胞系的可行性。
    材料:
    HEK-293細胞系穩(wěn)定表達三種熒光蛋白:
    AcGFP---多管發(fā)光水母中產(chǎn)生的另一種GFP(但不同于維多利亞水母)
    ZsGreen---與GFP相似,但更亮(來自珊瑚礁)
    DsRed---一種來自珊瑚礁的紅色熒光蛋白非轉(zhuǎn)染的HEK-293細胞系,作為對照
     
    方法:
    細胞準(zhǔn)備與分析
    細胞都培養(yǎng)在大燒瓶中,應(yīng)用含10% FBS+ 1% Pen/Strep/L-glutamine +500 μg/mL G 418的DMEM的培養(yǎng)基。沒有轉(zhuǎn)染的HEK-297細胞作為對照。在實驗前一夜,對細胞進行胰酶消化,然后進行密度梯度稀釋,zui終密度范圍為從 500,000到100個細胞每毫升。然后把它們過夜接種到96孔(100ul)和384孔(25ul)板中。因此,接種的細胞密度就是50,000到 10個細胞每孔(96孔板)和12,500到2.5個細胞每孔(384孔板)。每個稀釋都做12個重復(fù)。第二天分別用SpectraMax M5和Gemini EM兩臺儀器對酶標(biāo)板進行底讀和頂讀檢測。
     
    波長優(yōu)化
    SpectraMax M5和Gemini EM都是基于單色器的掃描式熒光讀板儀。針對每一個特殊熒光染料,其激發(fā)波長和發(fā)射波長都可以在背景之上進行信號優(yōu)化,這點也是濾光片式酶標(biāo)儀所不具備 的??偟膩碚f,優(yōu)化策略就是:用低于理論zui大激發(fā)波長20-25nm的激發(fā)光激發(fā),然后初掃發(fā)射波長;其次用高于理論zui大發(fā)射波長20-25nm的發(fā)射光 掃激發(fā)波長。掃描后將給出實際的激發(fā)與發(fā)射波長。zui后可以結(jié)合信號/背景分析再做其他額外的掃描來確定zui終的結(jié)果。(根據(jù)斯托克頓位移理論,激發(fā)波長應(yīng)該 更低、發(fā)射波長應(yīng)該更高,并且需要一個發(fā)射光阻隔濾片來隔離掉非目的波長的光信號)。而且可能還會因為要選擇*阻隔濾片而再進行兩次掃描。
     
    結(jié)果:
    波長優(yōu)化
    用Gemini EM對DsRed進行波長掃描,以此舉例如何進行波長優(yōu)化。為了檢測zui大激發(fā)波長, 我們首先固定發(fā)射波長為600nm,然后對發(fā)射波長進行掃描。掃描結(jié)果顯示zui大激發(fā)波長為556nm。(圖1)同樣為了檢測zui大發(fā)射波長,我們固定激發(fā)波 長為535nm,然后掃描發(fā)射波長,從而得到584nm的結(jié)果。(圖2)激發(fā)與發(fā)射值都與被發(fā)表的波長結(jié)果557/579相近。
     
     
     
    下一步就是要結(jié)合信號/背景優(yōu)化結(jié)果確定*激發(fā)和發(fā)射波長。因為初步檢測結(jié)果的斯托克頓位移偏小(22nm),顯然是要通過降低激發(fā)波長和增 大發(fā)射波長來擴大兩者之間的差異,其次還需要找到合適的發(fā)射光阻隔濾片優(yōu)化*靈敏度。zui終,我們使用5 5 0nm的激發(fā)波長來激發(fā), 同時使用570nm的發(fā)射光阻隔濾片隔離掉不想要的高于570nm以上的激發(fā)光。通過575到600nm的發(fā)射波長掃描DsRed轉(zhuǎn)染的細胞,結(jié)果顯示在 587-588nm處會有峰值出現(xiàn)(圖3,上面的曲線)。背景(沒有轉(zhuǎn)染的細胞)區(qū)域中,點就相對比較平緩(圖3,下面的曲線)?;诒敬螔呙瑁覀儂ui終 優(yōu)化的設(shè)置為550nm激發(fā)、588nm發(fā)射、575nm作為發(fā)射光阻隔濾片。
    觀察到的zui大值與我們建議用于定性分析的設(shè)置都總結(jié)在列表1中。
     

     
     
    細胞稀釋的結(jié)果
    采用底讀得到的細胞稀釋結(jié)果詳見圖4(96孔板)和圖5(384孔板)。頂讀結(jié)果詳見圖6(96孔板)和圖7(384孔板)。ZsGreen細 胞系(上面的曲線)的亮度是其它兩種細胞系的將近3.5倍。盡管DsRed細胞系的結(jié)果暗于ZsGreen,但兩種細胞系的檢測靈敏度卻相近。(列表2的 下圖),因為背景值低于DsRed的波長。
     

     
     
     
     
    總的來說,圖中的點稍微有些非線性,zui上方會有一點下降。我們推斷是因為細胞在高濃度時,會有貼壁生長的趨勢,所以會造成非線性的結(jié)果。列表2 給出了所有細胞系確認得到的檢測下限L L D 。其中L L D 的計算方法是:3SDBLANK/Slope,SDBLANK是背景孔(沒有細胞的培養(yǎng)基)的標(biāo)準(zhǔn)差,Slope是曲線底部的斜率。(對于96孔板和 384孔板,分別使用了10,000個細胞每孔和2500個細胞每孔的數(shù)據(jù))。非轉(zhuǎn)染細胞的RFU信號和標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果都與只含有培養(yǎng)基的結(jié)果相似。
    在本次實驗中,ZsGreen和DsRed細胞系在底讀模式都有著相似的檢測限,而且兩者都比AcGFP細胞系的檢測下限低3到4倍。本次實驗 一共重復(fù)了三次,但是DsRed實驗結(jié)果并不是每次都能表現(xiàn)的足夠好。在一次實驗中,它的檢測下限近似于AcGFP,但是在另一次實驗中,它的檢測下限又 會很高。我們將這些區(qū)別歸結(jié)于不同細胞系的通道數(shù)目不同。(伴隨著一個成功的通道,細胞就會變得越暗)DsRed細胞系在實驗開始階段比其它細胞系長得 快,所以在*次實驗中,它比其它細胞系多2-4倍的通道,結(jié)果就顯然不夠理想。
     

     
     
    對于AcGFP和ZsGreen細胞系,當(dāng)采用頂讀時,檢測下限升高將近三倍。另一方面,對于DsRed,當(dāng)采用頂讀時,檢測下限會升高將近 10-20倍。我們認為造成這種靈敏度下降的原因在于DMEM培養(yǎng)基有紅色熒光信號,會對結(jié)果有內(nèi)部干擾。事實也證明,將培養(yǎng)基換成無色的HBSS,相應(yīng) 的DsRed的頂讀結(jié)果也會變好。列表3展示了將有色培養(yǎng)基換成無色培養(yǎng)基的結(jié)果。底讀并沒有太多改變(盡管AcGFP的檢測下限看起來改善了),證明這 種操作方法并沒有導(dǎo)致細胞的損失。然而頂讀結(jié)果卻讓靈敏度改善了將近三倍。這些結(jié)果也從某一方面支持了一種理論,那就是有色培養(yǎng)基會一定程度上影響頂讀的 靈敏度。
     
     
     
    細胞混合結(jié)果
    在本次實驗中,我們在一個96孔板里混合了多種細胞,保證每個孔大約50,000個細胞。因此,如果是1:1混合,那么每種細胞會有 25,000個。如果是1:1:1混合,那么每種細胞將有1 6 , 7 0 0 個。實驗板分別用480/510nm(AsGFP和ZsGreen的優(yōu)化結(jié)果)和550/588nm(DsRed設(shè)置)的激發(fā)和發(fā)射來檢測。觀察到的 RFU值與預(yù)測值接近。結(jié)果總結(jié)如下。結(jié)果顯示,AsGF P和ZsGreen可以和DsRed一起檢測,反之亦然。(見圖表4)
     
     
     
    結(jié)論
    Molecular Devices公司的熒光讀板儀可以檢測完整貼壁細胞中的熒光蛋白。波長掃描可調(diào)的功能可以優(yōu)化每一種*熒光染料的波長結(jié)果。底讀模式提供*檢測靈敏 度,頂讀模式也可以提供可利用的數(shù)據(jù),尤其是對含有ZsGreen和DsRed的細胞系。頂讀模式檢測DsRed細胞系時,可以通過替換無色培養(yǎng)基來達到 優(yōu)化實驗結(jié)果的目的。

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