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    多功能酶標(biāo)儀中熒光檢測(cè)技術(shù)介紹

    更新時(shí)間:2016-03-30      點(diǎn)擊次數(shù):2022
             室溫下,大多數(shù)分子處于基態(tài)的zui低振動(dòng)能級(jí),處于基態(tài)的分子吸收能量(光能、化學(xué)能、電能或熱能)后躍遷至激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定,將很快衰變到 基態(tài),以光的形式放出能量,這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光現(xiàn)象”。分子發(fā)光包括熒光,磷光,化學(xué)發(fā)光,生物發(fā)光等。受到光照時(shí)發(fā)光,光照切斷時(shí)發(fā)光立即消失的叫熒 光,光照切斷時(shí),發(fā)光逐漸變?nèi)跻灾孪У慕辛坠?,吸收化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)能量而發(fā)光叫化學(xué)發(fā)光,由生物能轉(zhuǎn)變?yōu)楣廨椛涞姆Q作生物發(fā)光。
    由于發(fā)光物質(zhì)不同熒光有分子熒光和原子熒光之分,分子熒光為帶光譜,原子熒光為線光譜,通常所說的熒光為分子熒光。通過測(cè)定所發(fā)射熒光的特性和強(qiáng)度,可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。

    2.
    熒光檢測(cè)技術(shù)
    2.1熒光強(qiáng)度(FI)
    熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比,這是熒光分析法是量分析的依據(jù)。在生物學(xué)上的應(yīng)用非常廣泛,可以進(jìn)行生物大分子定量,酶活性分析,熒光免疫分析,細(xì)胞學(xué)分析(細(xì)胞增殖,細(xì)胞毒理,細(xì)胞吸附等)和分子間相互作用。
    2.1.1細(xì)胞凋亡檢測(cè)
    Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用,其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子,它在凋亡 信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞漿中,在凋亡的早期階段,它被激活,活化的Caspase-3由 兩個(gè)大亞基(17KD)和兩個(gè)小 亞基(12KD)組成,裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物,zui終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞,caspase-3的活性明顯下降。

    設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí),AMC不能被激發(fā)熒光,短肽被水解后釋放出AMC,自由 的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光(圖1)。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小,可以測(cè)定 caspase-3的活性,從而反映Caspase-3被活化的程度。


    圖1. Caspase-3水解Z-DEVD- AMC


    2.1.2
    細(xì)胞毒性的檢測(cè)
    體外細(xì)胞毒性研究對(duì)于檢測(cè)新的生物來源或人工合成的細(xì)胞毒素以及例行的臨床相關(guān)的檢測(cè)都有著重要的意義。細(xì)胞膜非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的細(xì)胞膜,熒光密度越高反映出其受損細(xì)胞越多。

    2.1.3
    鈣流檢測(cè)
    Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+熒光指示劑,可以靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化,當(dāng)結(jié)合鈣離子時(shí),zui大激發(fā)波長會(huì)發(fā)生改變,發(fā)射熒光的強(qiáng)度和結(jié)合的Ca2+濃度有著定量的關(guān)系。

    2.2
    熒光偏振(FP)
    1926年P(guān)errin首先描述了熒光偏振理論,溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時(shí),可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光,如果在激發(fā)時(shí)熒光物質(zhì)處 于靜止?fàn)顟B(tài),發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性,如果其處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài),發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性,這就是熒光偏振現(xiàn)象,熒光分子與 其它因子的相互作用,例如相互結(jié)合或排斥;其所處環(huán)境的性質(zhì),例如溶液的粘度、溫度等,這些因素都有可能對(duì)這個(gè)熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn) 生影響。因此以熒光偏振為基礎(chǔ)發(fā)展的技術(shù)可用來研究生命科學(xué)中分子之間的相互作用,如受體配體結(jié)合分析,DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合分析,SNP分析,酶活性分 析。

    熒光偏振分析所需的樣品量少,靈敏度高,可達(dá)亞納摩爾級(jí)范圍,重復(fù)性好,操作簡(jiǎn)便,也更為安全可靠,不會(huì)在實(shí)驗(yàn)過程中生成有害的放射性廢物,此外熒光偏振是真正均相的,允許實(shí)時(shí)檢測(cè)(動(dòng)力學(xué)檢測(cè)),對(duì)于濃度變化不敏感,是均相檢測(cè)形式(中間不含洗滌步驟)的*解決方案。

    目前市場(chǎng)上多款酶標(biāo)儀都可以用來做熒光偏振檢測(cè),Invitrogene公司專門利用Predictor™ hERG對(duì)多款酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光偏振測(cè)試分析(表1)。

     

    2.3
    時(shí)間分辨熒光(TRF)
    在做熒光測(cè)定的時(shí)候,由于背景熒光信號(hào)干擾,使用傳統(tǒng)的發(fā)色團(tuán)進(jìn)而進(jìn)行熒光檢測(cè)的靈敏度就會(huì)嚴(yán)重下降。大部分背景熒光信號(hào)是短時(shí)存在的,因此使用長衰減壽命的標(biāo)記物就可以使瞬時(shí)熒光干擾減到zui小化。
    時(shí)間分辨熒光是用稀土元素作為標(biāo)記物,稀土三價(jià)離子的電子云的結(jié)構(gòu)會(huì)一定程度上限制了電子的遷移,導(dǎo)致這類元素發(fā)生 的熒光的衰減周期通常是很長的,從而消除背景熒光的干擾 大大提高檢測(cè)的靈敏度(表2)。應(yīng)用稀土元素作標(biāo)記物的另一個(gè)好處是激發(fā)光與發(fā)射光峰值Stoke 位移大。這就可消除激發(fā)光和散射光的干擾,同時(shí), 被激發(fā)的熒光光帶極窄, 熒光的發(fā)射峰非常尖銳, 可使儀器調(diào)整在極窄的波長范圍內(nèi)測(cè)定, 極大地降低了來自背景的各種干擾。
    熒光團(tuán)
    熒光壽命(ns)
    非特異熒光背景
    1~10
    人血清白蛋白
    4.1
    球蛋白
    3.0
    細(xì)胞色素C
    3.5
    異硫氰酸熒光素(FITC)
    4.5
    丹磺酰氯
    14
    稀土螯合物
    103~106
    表2.常見熒光團(tuán)隊(duì)熒光壽命
    時(shí)間分辨熒光靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、標(biāo)記物制備簡(jiǎn)便、檢測(cè)重復(fù)性好、操作流程短,適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)上的超微量分析,像激素檢測(cè),病毒性肝炎標(biāo)志物檢測(cè),靶向細(xì)胞的標(biāo)記檢測(cè)以及藥物篩選等方面。

    2.4
    熒光共振能量傳遞(FRET)
    熒光共振能量傳遞現(xiàn)象是Perrin在20世紀(jì)初首先發(fā)現(xiàn)的,1948年,F(xiàn)oster創(chuàng)立了理論原理,指熒光能量供體與受體間通過偶極-偶極 耦合作用轉(zhuǎn)移能量的過程,這種能量的轉(zhuǎn)移是非放射性的,產(chǎn)生FRET的條件主要有三個(gè):(1)供體與受體間足夠靠近(1~10 nm);(2)供體的發(fā)射光譜與受體的激發(fā)光譜有一定的重疊;(3)給體與受體的偶一定的空間取向,這是偶極-偶極耦合作用的條件。
    熒光共振能量傳遞因?yàn)橐紤]到供體和受體之間的距離,所以經(jīng)常用來研究分子間的相互作用,像蛋白質(zhì)的相互作用,抗原抗體結(jié)合,受體與配體的結(jié) 合,另外在膜反應(yīng)、離子通道等方面的研究也有相應(yīng)應(yīng)用。將FRET熒光探針標(biāo)記的肽鏈,加入到固體表面的雙層膜中,通過熒光漂白恢復(fù)(FRAP)成像技術(shù) 檢測(cè),為研究跨膜螺旋二聚作用提供一個(gè)新的方法。用FRET標(biāo)記細(xì)胞質(zhì),應(yīng)用時(shí)間分辨技術(shù),檢測(cè)其對(duì)P2X離子通道的門控作用。

    利用Eu等長效熒光物質(zhì)作為供體,來進(jìn)行熒光共振能量傳遞,在激發(fā)光熄滅后受體仍能較長的能量衰減時(shí)間,能量傳遞效率更高,可檢測(cè)的相互作用距離更長,可達(dá)到100-200nm,時(shí)間延遲檢測(cè),降低了背景噪音,提高了靈敏度

    3.
    總結(jié)
    熒光法靈敏、準(zhǔn)確、兼容性強(qiáng)、可以利用熒光分子對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行特異性標(biāo)記大大減少雜質(zhì)的信號(hào)干擾,熒光特性參數(shù)多,動(dòng)態(tài)線性范圍寬、可以活細(xì)胞 活活體檢測(cè),靈敏度比分光光度法高2~4個(gè)數(shù)量級(jí),對(duì)微量和痕量藥物進(jìn)行靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)具有較大的*性??傊疅晒夥ㄗ鳛橐环N高靈敏的分析手段,與其它技 術(shù)相結(jié)合,有著更廣闊的發(fā)展前景。

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