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色氨酸羥化酶(Th)ELISA 試劑盒
夾心法常用于檢測(cè)大分子抗原,一般的操作步驟為:
將具有專一性的抗體固著(coating)于塑膠孔盤(pán)上,完成后洗去多余抗體
加入待測(cè)檢體,檢體中若含有待測(cè)的抗原,則其會(huì)與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
洗去多余待測(cè)檢體,加入另一種對(duì)抗原專一的一次抗體,與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)
洗去多余未鍵結(jié)一次抗體,加入帶有酶的二次抗體,與一次抗體鍵結(jié)
洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,加入酶底物使酵素呈色,以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果
色氨酸羥化酶(Th)ELISA 試劑盒
用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性:有高度的活性和敏感性;在室溫下穩(wěn)定;反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn);能商品化生產(chǎn)。當(dāng)前應(yīng)用較多的有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等,其中以HRP應(yīng)用廣。
過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物中,辣根中含量高,從辣根中提取的稱辣根過(guò)氧化物酶(HRP),是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白(含糖量18%),分子量約40 000,約由300個(gè)氨基酸組成,等電點(diǎn)為pH 3-9,催化反應(yīng)的適pH值因供氫體不同而稍有差異,一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示:RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上,高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶,非酶蛋白約占 75%,不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫,催化反應(yīng)時(shí)的供氫體有幾種:(1)鄰苯二胺(OPD),產(chǎn)物為橙色,可溶性,敏感性高,大吸收值在490nm,可用肉眼觀察判別,容易被濃H2SO4終止反應(yīng),顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變,是目前國(guó)內(nèi)ELISA中常用的一種;(2)聯(lián)大茴香胺(OD),產(chǎn)物為橘黃色,大吸收值在400nm,顏色較穩(wěn)定;(3)5-氨基水楊酸(5-AS):產(chǎn)物為深棕色,大吸收值在449nm,部分溶解,敏感性較差;(4)鄰聯(lián)甲苯胺(OT)產(chǎn)物為藍(lán)色,大吸收值在630nm,部分溶解,不穩(wěn)定,不耐酸,但反應(yīng)快,顏色明顯。
工作原理
本試劑盒采用雙位點(diǎn)夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),測(cè)定樣品中的水平。向預(yù)先包被抗體的酶標(biāo)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本和HRP標(biāo)記的抗體,經(jīng)過(guò)溫育和洗滌,去除未結(jié)合的組分,然后再加入底物A、B,產(chǎn)生藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中的濃度呈正相關(guān)。
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